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焦虑症海马神经元损伤分子生物学机制及丹栀逍遥散干预的研究进展

桂丹1,富文俊2,虢周科3*

(1.广州中医药大学,广州 510000 2.广州中医药大学中医基础理论教研室,广州 510000 3.广州中医药大学附属深圳临床医学院,深圳 518000)

[摘要]关于焦虑症准确的发病机制目前研究比较一致地认为存在大脑海马神经元的损伤,国外研究指出该损伤与蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)的调控、α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的表达有重要关系,因此笔者认为PP2A活性的改变,可继发α-syn异常表达,引起神经元的相关改变;那么通过调控PP2A活性,可能引起α-syn蛋白C端129位的丝氨酸磷酸化/去磷酸化,从而调控GR活性,抗海马神经元凋亡,达到修复受损海马,抗焦虑的作用。本文综述了近年有关蛋白磷酸酶2A,α-突触核蛋白在焦虑症的分子生物学机制的研究进展和中医药复方丹栀逍遥散治疗焦虑症机理的实验研究进展。

[关键词]焦虑症;丹栀逍遥散;海马;α-突触核蛋白;蛋白磷酸酶2A;综述

Advances inMechanisms of Molecular Biology of Danzhi Xiaoyao San in Anti Hippocampal Neuronal Damage of Anxiety Disorder

GUI Dan1,FU Wen-jun2,GUO Zhou-ke3*

(1. Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000 China 2.Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine(TCM), Guangzhou University ofChinese Medicine,Guangzhou 510000 China 3. Shenzhen TCM Hospital, GuangzhouUniversity of Chinese Medicine,Shenzhen 518000 China)

[Abstract]:It was widely accepted, in thepresent studies on the exact pathogenesis of anxiety disorders, that there is injuryof hippocampal neurons in brain. Overseas studies indicate that injury play animportant role in the regulation of protein phosphatase 2A (protein phosphatase2A, PP2A) and the expression of α-synuclein (α-synuclein). Therefore, weconsider that the change in the activity of PP2A may induce the abnormalexpression of α-syn, causing relative changes in neurons; so thephosphorylation / dephosphorylation of 129 points α-syn protein C-terminal9might be caused through regulating the activity of PP2A , then GR activityagainst neuronal apoptosis are further regulated, to repair damagedhippocampus, then to work in the anti-anxiety disorder. This paper reviews theresearch progress on the protein phosphatase 2A, α-synuclein in the molecularmechanisms of anxiety disorders and the progress on experimental study of themechanism of Chinese medicine compound Danzhi Xiaoyao San(DZXYS) in the treatment of anxiety disordersin recent years..

[Keywords] anxiety;Danzhi Xiaoyao San;hippocampal;alpha-synuclein;proteinphosphatase 2A;summary

焦虑症(anxietydisorders)又被称为焦虑性神经症,是一种以焦虑情绪为主的神经症,主要表现为发作性或持续性的焦虑、紧张、惊恐不安等焦虑情绪,并伴有自主神经紊乱、肌肉紧张与运动不安等症状。而慢性应激是一种持久的过度应激,是导致许多慢性疾病特别是神经精神疾病的重要病因。相关研究指出应激是焦虑症产生的重要原因之一[[i]]。

焦虑症与外界环境和社会心理因素有重要的因果关系。应激导致脑内生理生化异常,特别是海马损伤。大量研究表明,慢性应激或长期外源性糖皮质激素(glucocorticoid)处理可选择性损伤海马,使其神经细胞丢失,神经树突萎缩,突触点减少,糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor ,GR)减少,因而损伤海马在HPA轴反馈抑制中的作用,最终导致焦虑症的产生[[ii]],海马则是应激损伤的敏感区。近年来α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn),蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是焦虑症的分子生物学机制中的研究热点,有效调控PP2A活性,可能引起α-syn蛋白C端129位的丝氨酸磷酸化/去磷酸化,从而调控GR活性,对抗海马神经元凋亡,修复受损海马,抗焦虑的作用,这可能是焦虑症NR-GC/GR-HPAA这一信号通路的下游机制,文中重点综述了它们在机制中起到的重要作用。

1 应激引起焦虑症海马损伤的相关机制研究进展

应激(Stress)由加拿大心理学家Hans Selye于20世纪30年代提出,根据其对机体影响的性质及程度,分为生理性应激和病理性应激。病理性应激在医学上又分为急性应激和慢性应激[[iii]]。各种应激源引起的应激反应长期存在,或者机体对应激的调整无效,继发各种病理性改变,即慢性应激损伤。慢性应激损伤,对大脑的影响相当广泛,包括局部结构形态,还有大范围神经网络连接。比如导致海马体积、外侧和内侧前额叶的皮层厚度发生异常。国外研究指出海马可能是映射焦虑疾患之间异同的一个重要的大脑轨迹。焦虑和恐惧在功能上与海马纵向轴线的不同细分相关联:人体后部(啮齿动物背侧)海马是参与记忆,通过连线与内侧前额叶-内侧壁层默认模式的网络,而前壁(啮齿动物腹侧)海马通过连接带边缘,前额叶回路参与焦虑[[iv]]。

Dias等[[v]]研究指出由应激所致的焦虑存在海马神经元 损伤,如神经母细胞和树突分支减少,这种海马神经可塑性的变化可能是焦虑症发生机制的重要环节。他的研究结果显示血清皮质酮水平升高,GR表达降低;新生神经元的数量减少,脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和树突的表达增加;γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)在海马的低比率释放,脊柱密度的增加,这可能是由高皮质酮触发的海马区神经母细胞和树突分支的减少的一种代偿性机制。有人建立慢性强迫游泳的应激模型,发现大鼠的海马结构明显受损。研究表明, 海马在焦虑、恐惧的调节中发挥重要作用,海马整个结构或背侧损害导致大鼠活动过度,焦虑增强。有研究[[vi]]已表明4周强迫游泳引起海马结构的损害,海马区的神经细胞对应激的破坏作用最敏感。在应激过程中,海马参与整合感知的信息、解释环境信息的意义以及调控生物体的行为和神经内分泌反应[[vii]]。多项研究提示应激可导致大脑特定部位、尤其是海马区的神经元萎缩。

Α-突触核蛋白的异常聚集,细胞凋亡,导致海马神经元损伤,是近年来国内外研究海马神经损伤和神经变性疾病的热点。本文重点探讨了其对焦虑症海马神经元的损伤调节可能的作用机制。

2 α-突触核蛋白与海马神经元损伤的关系

2.1α-突触核蛋白生物学功能 α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)是一种中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,由140个氨基酸残基组成,分子量19 kDa,结构相对保守,主要呈囊泡结合型或膜结合型状态,α-syn的氨基酸序列通常被分成 3 个区域:N端(aa 1~60)含有KTKEGV重复序列,易形成两性α-螺旋,类似载脂蛋白的脂质结合区域,是介导α-syn与脂质膜结合的区域;中部NAC(Non-myloid component)区(aa 61~95)的疏水区域易形成β片层结构,在体外极易聚集且可促进全长α-syn的聚集;C末端(aa 96~140)主要由酸性氨基酸组成,带有大量负电荷,具有较强的亲水性?;肪郴蚧虻母谋浼滓穰?syn发生错误折叠,同时其二级结构可因环境的改变而出现动态变化,蛋白质出现寡聚体,纤维性蛋白质逐渐增多,因主要位于神经突触和细胞核膜而得名。研究共发现200多种与突触核蛋白基因同源的蛋白质,统称为突触核蛋白,分为A,B,C 3种类型,只有α-syn与神经损伤疾病有关[[viii]]。

到目前为止,还没有全面地认识α-syn的生物学功能,但是现有资料至少表明α-syn具有以下几种功能:调节突触的可塑性、整合突触前信号、调节突触处的多巴胺含量、调节小胶质细胞活性、热休克蛋白样作用、参与脂代谢调节[[ix]]。

2.2α-突触核蛋白的异常聚集可导致海马神经元损伤 近年研究发现,α-syn基因突变及其结构和功能障碍与包括帕金森病(parkinson"s disease,PD),阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)在内的多种神经损伤疾病的病理机制密切相关,而且在焦虑症、抑郁症等精神神经类疾病的发病环节中发挥重要作用?;肪郴蚧蛞蛩鼐梢ⅵ?syn的错误折叠,二级结构改变形成寡聚体,导致蛋白功能紊乱,形成异常蛋白质。寡聚体可与突触囊泡结合并产生小孔,增加囊泡的通透性,引起钙离子内流、多巴胺外漏以及线粒体膜去极化,致使神经元死亡。它多以酸性的头部和细胞膜结合,这种结构的特性使突触核蛋白容易发生自我聚集。α-syn的表达和促进突触核蛋白聚集体的形成使得突触核蛋白逃避清除系统的控制, α-syn的高表达会导致线粒体功能失常[[x]]。最新研究[[xi]]表明广泛的过表达α-syn可导致脑部特定区域的线粒体损伤。Rockenstein等[[xii]]通过创建许多合成的α-syn突变产生的物种,即其优先形成低聚物和增加α-syn介导的细胞毒性作用,发现了α-syn寡聚体在突触的积累会导致神经退行性病变可能的机制,并通过比较小鼠模型之间的突触损伤的图案,其中积累生成的各种形式的α-syn,高表达α-syn的小鼠显示突触和树突损失,突触素和突触囊泡的减少的水平,和行为缺陷等类似的改变,这些结果支持了积累低聚α-syn可以通过破坏突触小泡介导突触早期病理,造成海马神经元损伤。

研究表明还有一种导致损伤可能的机制为脑内胰岛素信号转导障碍,葡萄糖利用减少,使突触功能受损,异常聚集后,作为细胞内的一种毒性物质,可进一步扰乱正常的细胞功能,影响突触传递效能。另外,α-syn的合成增加也可能是一种代偿机制,以促进突触前递质的释放,维持丧失的突触功能,但这种代偿性的?;せ撇⒉荒苊植蛊渌鹕俗饔?。

2.3焦虑症存在α-syn的异常表达 Marxreiter等[[xiii]]研究证实α-syn的聚集损害海马神经元的突触功能和与在记忆障碍相关的神经元的功能,增加焦虑障碍。Chiavegatto等[[xiv]]通过调查α-syn同Lewis (LEW)和自发性高血压(SHR)近交系大鼠,即焦虑遗传模型,证实了α-syn在多巴胺神经传递的下调中非常重要的这一假设,确定了在品系不同的大鼠之间的α-syn基因的3"-非翻译区(3"- UTR)有一种新的单核苷酸多态性。该核苷酸可能参与LEW和SHR大鼠之间α-syn的差异性表达。正是这种α-syn的差异性表达调节了大鼠焦虑样行为。α-syn基因的多态性,与人类焦虑相关病症的脆弱性的可能性需要进一步深入研究。Rothman等[[xv]]研究发现α-syn的转基因小鼠具有焦虑表型。国外也有一项关于PD的研究提出,过表达α-syn的转基因小鼠表现出正常的条件和多巴胺β-羟化酶响应束缚应激异常的适应性反应的调控下,增加焦虑样行为[[xvi]]。

3 PP2A与α-syn可能存在的关联性

3.1PP2A的分子生物学功能 PP2A是一种丝/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphatase,PP2A),是真核生物体内存在最广泛的蛋白磷酸酶之一,可以调控大部分细胞生命活动,在细胞生物学中起到重要的作用,包括细胞周期调节、细胞增殖与凋亡、细胞骨架动力学、细胞迁移等,能使蛋白质脱磷酸[[xvii]]。PP2A 全酶由65KD结构亚单位A(PR65亚单位)和36KD催化亚单位C以及一个可变的调节亚基B组成,其中A亚基作为支架蛋白连接B和C亚基独具PP2A 的催化活性,调节亚基B决定了PP2A 的特异性、亚细胞定位以及全酶的催化活性,起到重要的调节作用。PP2A活性主要受全酶组装和催化亚单位C翻译后修饰的磷酸化和甲基化调节。众多内源性底物,广泛参与胞内受体信号传导系统:如cAMP、cGMP、受体酪氨酸激酶、胰岛素受体、细胞因子、神经酞胺、Wnt等信号传递系统,它也可与其他磷酸化酶和激酶组成大分子复合物的形式参与信号传导调节。PP2A 全酶的大多数生物学功能是以调节亚基B 与底物的特异性结合为前提,再由催化亚基C使底物去磷酸化实现。在哺乳动物中,PR55亚基是由4个基因( A,B, C,D) 编码的,它们在脑部的表达具有组织特异性,一系列神经变性疾病都涉及调节亚基PR55 的失调。国外的一项研究表明PP2A对底物蛋白的异常磷酸化,可导致海马损伤[[xviii]]。

3.2 PP2A与α-syn是应激过程中信号通道的重要组成部分 PP2A在神经元变性疾病中起到关键作用,α-Syn是积聚在帕金森病和广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder,GAD)等其他神经变性疾病的病理标志特征磷酸化聚集体的关键蛋白质。它在丝氨酸129位点磷酸化修饰促进聚集和具有神经毒性,可能是治疗靶标[[xix]]。Kang-Woo Lee等[[xx]]研究证实α-syn蛋白C端129位的丝氨酸磷酸化修饰可以引起PP2A的显著激活,由PP2A的催化亚基羧基甲基化大大提高,增强PP2A甲基化的饮食α-Syn的转基因小鼠,显着地减少双方的α-Syn的磷酸化丝氨酸129和大脑中的α-Syn的聚集。这些生化变化具有增强神经元的活动,增加树突,减少星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。这表明促进PP2A活性是可以调节丝氨酸129位磷酸化突触核蛋白病。Saito等[[xxi]]深入研究发现高水平磷酸化状态α-syn 可以引起神经元凋亡,损害中枢结构,且磷酸化修饰位点仅为C端129位的丝氨酸,这说明α-syn129位点磷酸化修饰在神经元凋亡过程中可能具有重要的作用。并且,Silvia Marina País等[[xxii]]研究则发现在应激状态下, PP2A是应激信号通路的组成部分,对这种α-syn129位点磷酸化修饰进行调控。Roe等[[xxiii]]研究也发现PP2A在应激造成的海马损伤修复中发挥了重要的作用。Yoshiki等[[xxiv]]研究证实可以通过调控PP2A以调节糖皮质激素受体(GR)及糖皮质激素(GC)的活性与敏感性。最近研究发现,在α-Syn 转基因小鼠中,增加PP2A 活力可以直接使α-Syn去磷酸化而减轻毒性作用。并且该研究结果提示,提高内源性PP2A 活力能够使α-Syn去磷酸化并显著减少细胞损伤[[xxv]]。因此,干预PP2A 的活性将有可能为α-Syn引起的细胞毒性提供?;ぷ饔肹[xxvi]]。由此说明PP2A与α-syn是应激过程中信号通道的重要组成部分,其对神经元的损伤与修复有着重要影响[[xxvii]]。最新研究[[xxviii]],显示抗神经变性药物诱导的磷酸化Ser129的α-syn降低始终与激活蛋白磷酸酶PP2A的哺乳动物靶标相关联。据此,我们推测,由PP2A介导,继发α-syn异常表达,引起神经元的相关改变可能是焦虑症糖皮质激素及糖皮质激素受体-下丘脑-肾上腺皮质轴(GC/GR-HPAA)这一信号通路的下游机制,更有待进一步深入研究。

4 传统医学对焦虑症的认识及研究进展

4.1中医的病因病机 中医学中并无焦虑症之名,追溯古籍,对于焦虑症的认识基于秦汉,萌芽于晋唐,发展于宋,完善于金元明清。从临床症状看,属于情志病范畴,可能与郁证、惊、恐、惊、心悸、怔忡、不寐、脏躁、卑惵、百合病、灯笼病等病症有关[[xxix]]。至现代,各医家基本达到共识,即认为焦虑症主要与外界环境刺激、七情内伤和个体素质遗传因素有关。综上所述,本病病位主要在肝和心,可涉及脾肾;主要病机为肝气不疏,气机郁滞,郁而化火,耗伤阴血,血不养心,脏腑虚弱,复加情志刺激,心主神明失司;或忧思过度,气机闭塞不行,使脏腑气机失调,累及心、肝、胆、脾、胃、肾,其中以肝、心、肾失调最常见,以气郁、火热居于主要地位。

4.2中药复方丹栀逍遥散治疗焦虑症的现代研究 目前国内中医药复方在抗焦虑领域的研究主要注重于疏肝解郁、宁心安神、健脾补肾方面的复方,或取经典成方,或据临床经验加减,并结合在国外心理疾病的认知治疗。其中丹栀逍遥散在临床上广泛应用于治疗抑郁焦虑等情绪失调病证,临床效果确切[[xxx]]。丹栀逍遥散出自明代薛己的《内科摘要》,又名加味逍遥散,是在宋代《太平惠民和剂局方》逍遥散的基础上加丹皮Paeoniasuffruticosa ,栀子Gardenia jasminoides 组成,具有疏肝健脾、和血调经功用,主治肝脾血虚,化火生热。薛红、虢周科等[[xxxi]]临床发现具有疏肝解郁清热作用的丹栀逍遥散具有较好的抗焦虑作用。李宁等[[xxxii]]通过建立慢性焦虑应激大鼠模型,观察行为学变化,并使用中药丹栀逍遥散进行干预,发现丹栀逍遥散具有明显的抗焦虑作用,但是其具体的作用靶点及通路未明确。也有研究[[xxxiii]]证实丹栀逍遥散具有显著的神经?;ぷ饔?。

徐志伟 [[xxxiv]-][[xxxv]]对丹栀逍遥散抗慢性心理应激损伤的机理方面做了大量实验研究,发现丹栀逍遥散能明显抑制慢性应激状态下HPA轴的过度激活,从而减轻应激造成的损伤,并通过大鼠群居接触实验和旷场实验这两种行为药理实验中用于筛选和观察抗焦虑药物的较为可靠的实验方法,证实逍遥散和丹栀逍遥散均具有一定的抗焦虑作用,但以丹栀逍遥散作用更佳,并对丹栀逍遥散的四种提取物进行药理学研究发现,丹栀逍遥散水提醇沉液部分具有明显的抗焦虑作用。吴丽丽等[[xxxvi]]也通过研究证实丹栀逍遥散及其提取物可以通过影响下丘脑CRH,血浆CORT水平参与对慢性心理应激反应的调控。有研究表明[[xxxvii]]丹栀逍遥散可以通过抑制慢性应激大鼠海马神经元细胞中GR的表达,促进受损海马结构修复。郭晓冬等[[xxxviii]]也证实可以通过调节海马内GR和MR的蛋白表达,使海马内GR和MR之间的比例关系均衡而起到治疗改善情绪病的作用。蔡大勇[[xxxix]]通过动物实验及细胞实验发现丹栀逍遥散可以使大鼠的神经元细胞变性坏死、胶质细胞增生、血管壁扭曲增厚等病变减轻,并使神经细胞突起内的病变明显好转,脑血管内皮损伤减轻、基底膜完整、胶质细胞足突规则。证实丹栀逍遥散可通过调整代谢、恢复功能、维持结构而防治神经元损伤,可以减轻自由基损害、促进轴浆运输、维持递质平衡和提高机体适应能力等机制产生疏肝理气、祛邪扶正的防治作用。据此,我们提出假说,由PP2A介导,继发α-syn异常表达,引起神经元的相关改变可能是焦虑症GC/GR-HPAA这一信号通路的下游机制,这是我们下一步研究工作的重点。

5结语

近年来关于精神神经疾病很多研究的在中枢单胺类神经递质代谢、神经内分泌系统紊乱、信号转导系统、基因组学、蛋白质组学等基础上,展开具有中医药特色的相关科研,取得了不少成果。综上所述,结合国内外研究的前期成果,提出科学假说如下:疏肝解郁清热方丹栀逍遥散可通过有效调控PP2A活性,引起α-syn蛋白C端129位的丝氨酸磷酸化/去磷酸化,从而调控GR活性,抗海马神经元凋亡,达到修复受损海马,抗焦虑的作用。这可能是焦虑症NR-GC/GR-HPAA这一信号通路的下游机制。目前α-syn及PP2A参与焦虑症的具体作用机制研究较浅,尤其需要采用大量动物实验去深入研究。目前已预测和验证了一些焦虑症发生的分子生物学机制,需要进一步大力尝试。

[参考文献](略)

[责任编辑 邹晓翠]

发表于2015年5月第9期

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